Projekt MEFANET (MEdical FAculties Educational NETwork)

RNDr. Martin Pešta, Ph.D.

Řazeno podle: priorita a čas poslední úpravy
 

Současná izolace DNA a RNA ze vzorku nádorové tkáně zalité v parafinovém bločků část 3. – Izolace DNA

Současná izolace DNA a RNA ze vzorku nádorové tkáně zalité v parafinovém bločků část 3. – Izolace DNA

Vzorky tkání fixovaných formalínem a zalitých v parafínu (FFPE) se běžně používají pro přípravu histologických preparátů. U těchto preparátů lze použít přehledná či speciální barvení pro zvýraznění požadovaných struktury nebo použitím protilátek (imunohistochemie) označit a vizualizovat zcela konkrétní typy molekul. Takto ošeřené vzorky (FFPE) se skladují desítky let. Dnešní postupy izolace nukleových kyselin (NA) umožňují izolaci DNA a RNA i z takto ošetřených tkání a využít tak tyto vzorky k analýze DNA a RNA, přestože pro tyto analýzy tyto vzorky nebyly původně určeny. V tomto videu uvidíte izolaci DNA z FFPE tkáně, nyní již deparafinované. Výhodou možnosti izolovat DNA z parafínových bločků je skutečnost, že se dostáváme k materiálu genomové DNA, která by byla za normálních okolností nedostupná /bločky z archivu/. Nevýhodou je, že musíme počítat s omezeními pro následné analýzy DNA. DNA je fragmentovaná, v méně čisté podobě, často máme omezený výtěžek a následné analýzy je tomu třeba přizpůsobit. Takto izolovanou DNA můžeme použít například k detekci mutací, polymorfismů, omezeně k sekvenaci.

 
autor: Martin Pešta | obor: Biologie | zobrazeno: 1157x | publikováno: 13.4.2015 | poslední úpravy: 13.4.2015 | Creative Commons License

Současná izolace DNA a RNA ze vzorku nádorové tkáně zalité v parafinovém bločků část 2. – Izolace RNA

Současná izolace DNA a RNA ze vzorku nádorové tkáně zalité v parafinovém bločků část 2. – Izolace RNA

Vzorky tkání fixovaných formalínem a zalitých v parafínu (FFPE) se běžně používají pro přípravu histologických preparátů. U těchto preparátů lze použít přehledná či speciální barvení pro zvýraznění požadovaných struktury nebo použitím protilátek (imunohistochemie) označit a vizualizovat zcela konkrétní typy molekul. Takto ošeřené vzorky (FFPE) se skladují desítky let. Dnešní postupy izolace nukleových kyselin (NA) umožňují izolaci DNA a RNA i z takto ošetřených tkání a využít tak tyto vzorky k analýze DNA a RNA, přestože pro tyto analýzy tyto vzorky nebyly původně určeny. V tomto videu uvidíte izolaci RNA z FFPE tkáně, nyní již deparafinované. Výhodou možnosti izolovat RNA z parafínových bločků je skutečnost, že se dostáváme k materiálu - celkové RNA, která by byla za normálních okolností nedostupná /bločky z archivu/. RNA je rychle degradována a tak takto staré vzorky vhodné pro izolaci RNA nejsou jinak dostupné. Nevýhodou je, že musíme počítat s omezeními pro následné analýzy. RNA je fragmentovaná, v méně čisté podobě, často máme omezený výtěžek a následné analýzy je tomu třeba přizpůsobit. Prostřednictvím takto izolované RNA nejčastěji hodnotíme expresi genů.

 
autor: Martin Pešta | obor: Biologie | zobrazeno: 949x | publikováno: 13.4.2015 | poslední úpravy: 13.4.2015 | Creative Commons License

Současná izolace DNA a RNA ze vzorku nádorové tkáně zalité v parafinovém bločků část 1. – Příprava vzorku a deparafinace

Současná izolace DNA a RNA ze vzorku nádorové tkáně zalité v parafinovém bločků část 1. – Příprava vzorku a deparafinace

Vzorky tkání fixovaných formalínem a zalitých v parafínu (FFPE) se běžně používají pro přípravu histologických preparátů. U těchto preparátů lze použít přehledná či speciální barvení pro zvýraznění požadovaných struktury nebo použitím protilátek (imunohistochemie) označit a vizualizovat zcela konkrétní typy molekul. Takto ošeřené vzorky (FFPE) se skladují desítky let. Dnešní postupy izolace nukleových kyselin (NA) umožňují izolaci DNA a RNA i z takto ošetřených tkání a využít tak tyto vzorky k analýze DNA a RNA, přestože pro tyto analýzy tyto vzorky nebyly původně určeny. Prvním krokem izolace NA je příprava řezů cílové tkáně. Tento postup je obsahem tohoto videa. Většinou připravujeme řezy dle hematoxylin-eosinových preparátů s vyznačenou oblastí, ze které budeme NA izolovat. Na mikrotomu nakrájíme několik řezů, které odstraníme (svrchní oxidovaná vrstva obsahuje nejvíce degradované NA). Následně připravíme 10-20 µm silné řezy o celkové velikosti přibližně 12x12 mm, ze kterých budeme izolovat DNA a RNA izolovat. Dále před vlastní izolací NA provedeme deparafinaci tkáně. Takto získanou tkáň již podrobíme lyzi a následně izolujeme DNA a RNA.

 
autor: Martin Pešta | obor: Biologie | zobrazeno: 1013x | publikováno: 13.4.2015 | poslední úpravy: 13.4.2015 | Creative Commons License

Detekce cirkulujících nádorových buněk (CTCs) v periferní krvi - PCR, elektroforéza a vyhodnocení

Detekce cirkulujících nádorových buněk (CTCs) v periferní krvi - PCR, elektroforéza a vyhodnocení

Přítomnost cirkulující buněk s vlastnostmi nádorových buněk v krvi pacienta s metastazujícím karcinomem pozoroval již v roce 1869 Thomas Ashworth. Přesto intenzivní výzkum těchto buněk probíhá až posledních 15 let. Dnes víme, že počet cirkulujících nádorových buněk ( CTCs) je ve vztahu k prognóze nádorového onemocnění a snížení počtu CTCs po podané chemoterapii je ve vztahu k odpovědi pacienta na léčbu. Již delší dobu používanou, přesto respektovanou, metodou detekce CTCs je izolace cirkulujících nádorových buněk je imunomagnetickou separací následovaná RT PCR. Toto výukové video navazuje na předchozí video „část 2. - izolace mRNA z CTCs a reverzní transkripce (RT)“ a ukazuje zakončení celého stanovení CTCs a to PCR, elektroforézu a vyhodnocení s klinickým závěrem.

 
autor: Martin Pešta | obor: Biologie | zobrazeno: 1046x | publikováno: 31.7.2014 | poslední úpravy: 31.7.2014 | Creative Commons License

Izolace cirkulujících nádorových buněk (CTCs) metodou imunomagnetické separace

Izolace cirkulujících nádorových buněk (CTCs) metodou imunomagnetické separace

Přítomnost cirkulující buněk s vlastnostmi nádorových buněk v krvi pacienta s metastazujícím karcinomem pozoroval již v roce 1869 Thomas Ashworth. Přesto intenzivní výzkum těchto buněk probíhá až posledních 15 let. Dnes víme, že počet cirkulujících nádorových buněk ( CTCs) je ve vztahu k prognóze nádorového onemocnění a snížení počtu CTCs po podané chemoterapii je ve vztahu k odpovědi pacienta na léčbu.
Již delší dobu používanou, přesto respektovanou, metodou detekce CTCs je izolace cirkulujících nádorových buněk je imunomagnetickou separací následovaná RT PCR. Toto výukové video je prvním dílem 3 videí popisujících tuto metodu, detekci cirkulujících nádorových buněk v krvi pacientky s karcinomem prsu. V díle " imunomagnetická separace CTCs" je vysvětlen princip metody a představena první část, tedy imunomagnetická separace CTCs.

 
autor: Martin Pešta | obor: Biologie | zobrazeno: 1166x | publikováno: 10.3.2014 | poslední úpravy: 7.4.2014 | Creative Commons License

Detekce cirkulujících nádorových buněk (CTCs) - izolace mRNA a reverzní transkripce (RT)

Detekce cirkulujících nádorových buněk (CTCs) - izolace mRNA a reverzní transkripce (RT)

Izolace mRNA z CTCs a reverzní transkripce (RT) Přítomnost cirkulující buněk s vlastnostmi nádorových buněk v krvi pacienta s metastazujícím karcinomem pozoroval již v roce 1869 Thomas Ashworth. Přesto intenzivní výzkum těchto buněk probíhá až posledních 15 let. Dnes víme, že počet cirkulujících nádorových buněk ( CTCs) je ve vztahu k prognóze nádorového onemocnění a snížení počtu CTCs po podané chemoterapii je ve vztahu k odpovědi pacienta na léčbu. Již delší dobu používanou, přesto respektovanou, metodou detekce CTCs je izolace cirkulujících nádorových buněk je imunomagnetickou separací následovaná RT PCR. Toto výukové video navazuje na předchozí video „Imunomagnetická separace CTCs“ a ukazuje další část postupu a to izolaci mRNA z CTCs a reverzní transkripci (RT). Ty to kroky umožní získat cDNA z původně izolovaných potenciálně přítomných CTCs a stanovit přítomnost exprese s nádory asociovaných genů HER-2, MUC1, EpCAM. Stanovení exprese jmenovaných genů metodou PCR uvidíte ve třetím videu.

 
autor: Martin Pešta | obor: Biologie | zobrazeno: 1349x | publikováno: 7.4.2014 | poslední úpravy: 7.4.2014 | Creative Commons License

Izolace DNA z plné krve adsorpcí na silikátovou membránu - ” kolonková metoda ”

Izolace DNA z plné krve  adsorpcí na silikátovou membránu -  ” kolonková metoda ”

Instruktážní video ukazuje metodu izolaci DNA z plné krve adsorpcí na silikátovou membránu. Metody izolace nukleových kyselin jsou v podstatě vždy posloupností těchto základních kroků: získání biologického materiálu, rozpad tkání a buněk, uvolnění nukleových kyselin z buněk, oddělení nukleových kyselin z makromolekulárních struktur, purifikace nukleových kyselin, rozpuštění nukleových kyselin ve vhodném objemu vody. Kolonková adsorbční metoda využívá silné adsorpce molekul DNA v přítomnosti chaotropních solí, např. guanidinium thiokyanátu k silikátové membráně. Výhodou této metody je rychlá izolace DNA bez znečištění proteiny a dalšími látkami. Video je určeno pro studenty všech ročníků.

 
autor: Martin Pešta | obor: Biologie | zobrazeno: 1649x | publikováno: 23.4.2013 | poslední úpravy: 30.10.2013 | Creative Commons License

Izolace DNA z plné krve modifikovanou vysolovací metodou

Izolace DNA z plné krve  modifikovanou vysolovací metodou

Instruktážní video zachycuje jednotlivé kroky izolace DNA z plné krve modifikovanou vysolovací metodou. Nejprve provedeme hemolýzu vodou nebo roztokem RCLB. Dále lyzujeme leukocyty a degradujeme membránové struktury (lýza jader) a proteiny. Odstraníme proteiny jejich vysolením nasyceným roztokem NaCl a odstraníme membránové struktury extrakcí do roztoku chloroformu a centrifugujeme. Odebereme vodnou fázi a DNA vysrážíme přidáním 96% etanolu. DNA rozpustíme ve vhodném objemu vody nebo pufru TE. Tato metoda vyžaduje pouze základní chemikálie přítomné ve většině biochemických laboratoří. Další výhodou je získání velkého výtěžku izolované DNA. Video je určeno pro studenty všech ročníků.

 
autor: Martin Pešta, Jan Javůrek | obor: Biologie | zobrazeno: 1948x | publikováno: 10.5.2013 | poslední úpravy: 30.10.2013 | Creative Commons License