Vyhledávání

Vzorky tkání fixovaných formalínem a zalitých v parafínu (FFPE) se běžně používají pro přípravu histologických preparátů. U těchto preparátů lze použít přehledná či speciální barvení pro zvýraznění požadovaných struktury nebo použitím protilátek (imunohistochemie) označit a vizualizovat zcela konkrétní typy molekul. Takto ošeřené vzorky (FFPE) se skladují desítky let. Dnešní postupy izolace nukleových kyselin (NA) umožňují izolaci DNA a RNA i z takto ošetřených tkání a využít tak tyto vzorky k analýze DNA a RNA, přestože pro tyto analýzy tyto vzorky nebyly původně určeny. V tomto videu uvidíte izolaci DNA z FFPE tkáně, nyní již deparafinované. Výhodou možnosti izolovat DNA z parafínových bločků je skutečnost, že se dostáváme k materiálu genomové DNA, která by byla za normálních okolností nedostupná /bločky z archivu/. Nevýhodou je, že musíme počítat s omezeními pro následné analýzy DNA. DNA je fragmentovaná, v méně čisté podobě, často máme omezený výtěžek a následné analýzy je tomu třeba přizpůsobit. Takto izolovanou DNA můžeme použít například k detekci mutací, polymorfismů, omezeně k sekvenaci.

Materiál pojednává o historii výzkumu vedoucího k objevu struktury DNA. Víte, jakou roli v ní hrál bakteriofág? Práce je určena hlavně pro studenty I. ročníku všeobecného i zubního lékařství, ale také všem dalším zájemcům o biologii. Materiál obsahuje kapitoly, které se zabývají objevem bakterií, virů a DNA.

Extrakce DNA může znít jako složitý úkol, pro jehož provedení je nutná moderní laboratoř. Ve skutečnosti se ale jedná o jednoduchý proces, který zahrnuje několik obecných kroků a stačí nám k tomu vybavení z kuchyně a běžně dostupné chemikálie. V tomto experimentu je popsána extrakce DNA z fazolí. S podobným postupem ale lze ektrakci DNA provést z jakéhokoli biologického materiálu.

Instruktážní video zachycuje jednotlivé kroky izolace DNA z plné krve modifikovanou vysolovací metodou. Nejprve provedeme hemolýzu vodou nebo roztokem RCLB. Dále lyzujeme leukocyty a degradujeme membránové struktury (lýza jader) a proteiny. Odstraníme proteiny jejich vysolením nasyceným roztokem NaCl a odstraníme membránové struktury extrakcí do roztoku chloroformu a centrifugujeme. Odebereme vodnou fázi a DNA vysrážíme přidáním 96% etanolu. DNA rozpustíme ve vhodném objemu vody nebo pufru TE. Tato metoda vyžaduje pouze základní chemikálie přítomné ve většině biochemických laboratoří. Další výhodou je získání velkého výtěžku izolované DNA. Video je určeno pro studenty všech ročníků.

Instruktážní video ukazuje metodu izolaci DNA z plné krve adsorpcí na silikátovou membránu. Metody izolace nukleových kyselin jsou v podstatě vždy posloupností těchto základních kroků: získání biologického materiálu, rozpad tkání a buněk, uvolnění nukleových kyselin z buněk, oddělení nukleových kyselin z makromolekulárních struktur, purifikace nukleových kyselin, rozpuštění nukleových kyselin ve vhodném objemu vody. Kolonková adsorbční metoda využívá silné adsorpce molekul DNA v přítomnosti chaotropních solí, např. guanidinium thiokyanátu k silikátové membráně. Výhodou této metody je rychlá izolace DNA bez znečištění proteiny a dalšími látkami. Video je určeno pro studenty všech ročníků.

Vzorky tkání fixovaných formalínem a zalitých v parafínu (FFPE) se běžně používají pro přípravu histologických preparátů. U těchto preparátů lze použít přehledná či speciální barvení pro zvýraznění požadovaných struktury nebo použitím protilátek (imunohistochemie) označit a vizualizovat zcela konkrétní typy molekul. Takto ošeřené vzorky (FFPE) se skladují desítky let. Dnešní postupy izolace nukleových kyselin (NA) umožňují izolaci DNA a RNA i z takto ošetřených tkání a využít tak tyto vzorky k analýze DNA a RNA, přestože pro tyto analýzy tyto vzorky nebyly původně určeny. Prvním krokem izolace NA je příprava řezů cílové tkáně. Tento postup je obsahem tohoto videa. Většinou připravujeme řezy dle hematoxylin-eosinových preparátů s vyznačenou oblastí, ze které budeme NA izolovat. Na mikrotomu nakrájíme několik řezů, které odstraníme (svrchní oxidovaná vrstva obsahuje nejvíce degradované NA). Následně připravíme 10-20 µm silné řezy o celkové velikosti přibližně 12x12 mm, ze kterých budeme izolovat DNA a RNA izolovat. Dále před vlastní izolací NA provedeme deparafinaci tkáně. Takto získanou tkáň již podrobíme lyzi a následně izolujeme DNA a RNA.

Vzorky tkání fixovaných formalínem a zalitých v parafínu (FFPE) se běžně používají pro přípravu histologických preparátů. U těchto preparátů lze použít přehledná či speciální barvení pro zvýraznění požadovaných struktury nebo použitím protilátek (imunohistochemie) označit a vizualizovat zcela konkrétní typy molekul. Takto ošeřené vzorky (FFPE) se skladují desítky let. Dnešní postupy izolace nukleových kyselin (NA) umožňují izolaci DNA a RNA i z takto ošetřených tkání a využít tak tyto vzorky k analýze DNA a RNA, přestože pro tyto analýzy tyto vzorky nebyly původně určeny. V tomto videu uvidíte izolaci RNA z FFPE tkáně, nyní již deparafinované. Výhodou možnosti izolovat RNA z parafínových bločků je skutečnost, že se dostáváme k materiálu - celkové RNA, která by byla za normálních okolností nedostupná /bločky z archivu/. RNA je rychle degradována a tak takto staré vzorky vhodné pro izolaci RNA nejsou jinak dostupné. Nevýhodou je, že musíme počítat s omezeními pro následné analýzy. RNA je fragmentovaná, v méně čisté podobě, často máme omezený výtěžek a následné analýzy je tomu třeba přizpůsobit. Prostřednictvím takto izolované RNA nejčastěji hodnotíme expresi genů.